生物體內存在著大量的級聯(lián)反應（如光合過程、代謝過程等），多種生物酶通過協(xié)同效應保證這些復雜反應高度有序地完成。為了模擬這樣的生物學過程，科學家們嘗試在體外人工制備多酶反應體系，利用酶各自的催化特性創(chuàng)造出復雜的多酶復合體 (Multi-enzyme complexes，MECs)，通過提高中間產物在不同酶間的運轉濃度，更高效地完成整個催化過程。同時，多酶體系也適用于原位輔酶再生過程，使規(guī)?；锎呋某杀镜玫接行Ы档?。
圖1. 多酶催化體系示意
近年來，多酶反應體系中的共固定化技術越來越受到關注。該技術是將多種酶固定在同一載體上形成共固定化系統(tǒng)，或通過交聯(lián)形成共交聯(lián)酶簇；相較于多酶共反應的方式（多種游離酶置于同一反應器中，進而得到目標產物），具有更高的酶穩(wěn)定性、重復利用率和產品收率。共固定化方法通常建立在單酶固定技術的基礎上，主要方法包括包埋、物理吸附、共價結合、親和吸附、DNA 定向自組裝固定和交聯(lián)酶聚集等，或將多種方法結合來制定策略。
多酶共固定化體系的建立非常具有挑戰(zhàn)性——不僅需要篩選合適的固定化方法，分析相關的反應動力學和傳質特征以確定最佳反應條件，盡可能保持體系中所有酶的活性和穩(wěn)定性，還要優(yōu)化平衡各催化組分使它們達到協(xié)同作用，最終設計出理想的固定化策略。
凱萊英醫(yī)藥集團（股票代碼：002821.SZ，以下簡稱“凱萊英”）技術團隊在多酶共固定化技術的研究中，不僅成功實現(xiàn)包括轉氨酶在內的多種酶的共固定化，并且嘗試將其與連續(xù)反應技術相結合，應用于藥物研發(fā)與生產環(huán)節(jié)中，使整個生物催化過程更高效、更環(huán)保、更可控。
多酶共固定化連續(xù)反應體系中，在底物濃度可控、產物不斷移除、無機械攪拌、壓力和溫度嚴格監(jiān)督的環(huán)境下，酶受到的影響非常有限，顯著增長了使用壽命，也更容易進行下游處理。尤其當許多催化過程在非均相條件下進行時，連續(xù)反應器卓越的混合效率可以轉化為對傳質的改善，從而加速整個過程，反應時間從幾小時大幅縮減到幾分鐘，空時產率（STY）可獲得高達650倍的提升，可輕松實現(xiàn)集成處理和分析控制。同時，連續(xù)反應還能通過精準的過程控制提升反應轉化率，有效減低三廢生成量。
凱萊英技術團隊的科學家們嘗試在轉氨基作用常規(guī)方法的基礎上建立多酶共固定化連續(xù)反應體系，以解決該類反應中產率和經濟性相關的多個難題。轉氨基作用是合成某些氨基酸的一條重要途徑，包括以丙氨酸作為氨基供體，底物酮酸通過氨基轉移酶轉化為氨基酸。由于丙氨酸的反應產物丙酮酸會對轉氨酶活性產生抑制作用，使得常規(guī)方法的轉化率僅有60％-70％。為了減輕這種抑制，研究人員使用LDH（乳酸脫氫酶）將丙酮酸轉化為乳酸，并將FDH/GDH用于NADH（還原型輔酶Ⅰ）的再生。
圖2. 多酶反應體系示例
凱萊英技術團隊嘗試將反應中的三種酶分別用幾種不同方法進行共固定，并應用于兩種連續(xù)流式反應器中，包括連續(xù)攪拌釜反應器（CSTR）和填充床反應器（PBR）。通過對固定化方法、載體、反應條件、反應器類型等多方面因素的篩選和平衡，研究人員優(yōu)選出最佳策略，成功建立了該反應的多酶共固定化連續(xù)反應體系，底物的轉化率得到大幅提升（>99%），可實現(xiàn)連續(xù)轉化200h以上。
多酶共固定化連續(xù)反應體系的研究過程并非兩種技術的簡單疊加，其結果卻是令人驚喜的“1+1>2”。隨著酶工程技術的進步，多酶共固定化技術將愈加成熟。相信人工制備的固定化多酶將更接近于天然的多酶復合體，并具有更強的催化效率。凱萊英致力于綠色化學制藥技術的開發(fā)與商業(yè)化應用，多酶共固定化和連續(xù)反應的有機結合將有望引領行業(yè)革新，以更綠色、更安全、更可靠的技術惠及全球醫(yī)藥產業(yè)與臨床患者。
